Քրոմատոգրաֆիան նյութերի տարանջատման մեթոդներից է։ Այն օգտագործվում է միկրոմասնիկների ֆիզիկական և քիմիական հատկությունների հետագա որակական և քանակական վերլուծության համար: Այս տեխնոլոգիայի տարբերակն է մերձավոր քրոմատոգրաֆիան: Մոլեկուլային մերձեցման հատկության օգտագործմամբ սպիտակուցային միացությունների տարբերակման գաղափարը գիտության մեջ հայտնի է մի քանի տասնամյակ: Այնուամենայնիվ, այն իր զարգացումը ստացել է միայն վերջին տարիներին՝ որպես մատրիցա օգտագործվող բարձր ծակոտկեն հիդրոֆիլ նյութերի ներդրումից հետո։ Այս մեթոդը թույլ է տալիս լուծել ինչպես անալիտիկ խնդիրներ (նյութերի առանձնացում և դրանց նույնականացում), այնպես էլ նախապատրաստական (մաքրում, համակենտրոնացում):
Էություն
Աֆինիտային քրոմատոգրաֆիան (լատիներեն affinis բառից՝ «հարակից», «կապակցված») հիմնված է մերձեցման փոխազդեցությունների վրա, որոնք առանձնահատուկ կապերի ձևավորում են միջակայքի մոլեկուլի (լիգանդ կամ աֆինանտ) և թիրախային մոլեկուլի միջև: Այս մեխանիզմները իրենց բնույթով լայնորեն տարածված են (միջնորդների կամ հորմոնների և ընկալիչների միացում, հակամարմիններ ևանտիգեններ, պոլինուկլեոտիդների հիբրիդացում և այլ տեսակի պրոցեսներ): Բժշկության մեջ մերձավոր քրոմատոգրաֆիան գործնական նպատակներով օգտագործվում է 1951 թվականից
Բաղադրիչները բաժանված են հետևյալ կերպ.
- աշխատանքային լուծույթը, որը պարունակում է մեկուսացման ենթակա նյութը, անցնում է սորբենտով;
- լիգանդը, որը դրված է սորբենտային մատրիցի վրա, պահպանում է այս նյութը;
- կենտրոնացված է (կուտակում);
- մեկուսացված նյութի արդյունահանում սորբենտից՝ լուծիչով լվանալով։
Այս մեթոդը թույլ է տալիս մեկուսացնել ամբողջական բջիջները: Տարբերությունը ավանդական սորբցիոն քրոմատագրությունից այն է, որ առկա է մեկուսացված բաղադրիչի ուժեղ բիոսպեցիֆիկ կապը սորբենտի հետ, որը բնութագրվում է բարձր ընտրողականությամբ:
Ադսորբենտներ
Հետևյալ նյութերը օգտագործվում են որպես ներծծող նյութեր.
- Գելային միացություններ՝ հիմնված ագարոզայի վրա՝ ագարից ստացված պոլիսաքարիդ: Առավել հաճախ օգտագործվում են 3 սորտեր՝ սեֆարոզ 4B, CL (խաչ կապված ագարոզա) և աֆֆիգել։ Վերջին կազմը ագարոզայի և պոլիակրիլամիդի փոփոխված գել է: Այն ունի ավելի մեծ կենսաբանական իներտություն, բարձր քիմիական և ջերմային դիմադրություն։
- Silica (silica gel).
- Ապակի.
- Օրգանական պոլիմերներ.
Լիգանդի շփման ժամանակ մեխանիկական խոչընդոտները վերացնելու համար օգտագործվում են լրացուցիչ նյութեր՝ այն կրիչից առանձնացնելու համար (պեպտիդներ, դիամիններ, պոլիամիններ, օլիգոսաքարիդներ):
Սարքավորում
Աֆինիտե քրոմատոգրաֆիայի սարքավորումը ներառում է հետևյալ հիմնական միավորները՝
- պահեստավորման տանկեր շարժական փուլի համար (էլյուենտ);
- բարձր ճնշման պոմպեր միջին մատակարարման համար (առավել հաճախ փոխադարձ);
- զտիչ՝ մաքրող նյութերը փոշուց;
- դոզավորման սարք;
- քրոմատոգրաֆիկ սյունակ խառնուրդի բաժանման համար;
- դետեկտոր՝ սյունակից դուրս եկող տարանջատված բաղադրիչները հայտնաբերելու համար;
- քրոմատոգրամա ձայնագրիչներ և միկրոպրոցեսորային միավոր (համակարգիչ):
Լուծված օդի քանակությունը նվազեցնելու համար հելիումը նախ անցնում է շարժական փուլով: Էլուենտի կոնցենտրացիան փոխելու համար տեղադրվում են ծրագրավորողի կողմից կառավարվող մի քանի պոմպեր: Քրոմատոգրաֆիկ սյուները պատրաստված են չժանգոտվող պողպատից (կոռոզիոն դիմադրության բարձր պահանջների համար), ապակուց (ունիվերսալ տարբերակ) կամ ակրիլից: Նախապատրաստական նպատակներով դրանց տրամագիծը կարող է տատանվել 2-ից 70 սմ: Անալիտիկ քրոմատագրության մեջ օգտագործվում են Ø10-150 մկմ միկրոսյունակներ:
Դետեկտորների զգայունությունը բարձրացնելու համար խառնուրդի մեջ ներմուծվում են ռեագենտներ, որոնք նպաստում են սպեկտրի ուլտրամանուշակագույն կամ տեսանելի հատվածում ավելի շատ ճառագայթներ կլանող նյութերի առաջացմանը:
Մեթոդաբանություն
Գոյություն ունի հեղուկ մերձեցման քրոմատոգրաֆիայի 2 հիմնական տեսակ՝
- Սյունակ, որում սյունը լցվում է անշարժ ֆազով և խառնուրդը դրա միջով անցնում հոսքովէլուենտ. Տարանջատումը կարող է տեղի ունենալ ճնշման կամ գրավիտացիայի տակ:
- Բարակ շերտ. Էլուենտը շարժվում է հարթ ներծծող շերտի երկայնքով մազանոթային ուժերի ազդեցությամբ: Ներծծող նյութը կիրառվում է ապակե ափսեի, կերամիկական կամ քվարց ձողի, մետաղական փայլաթիթեղի վրա:
Աշխատանքի հիմնական փուլերը ներառում են՝
- ադսորբենտի պատրաստում, լիգանդի ամրացում կրիչի վրա;
- տարանջատման խառնուրդը քրոմատոգրաֆիկ սյունակ սնուցում;
- շարժական փուլի բեռնում, բաղադրիչի կապում լիգանդի կողմից;
- փուլի փոխարինում կապված նյութը մեկուսացնելու համար:
Նպատակակետ
Աֆինիտային քրոմատոգրաֆիան օգտագործվում է հետևյալ տեսակի նյութերի մեկուսացման համար (օգտագործվող լիգանդի տեսակը նշված է փակագծերում).
- ֆերմենտային ինհիբիտորների, սուբստրատների և կոֆակտորների (ֆերմենտների) անալոգներ;
- կենսօրգանական նյութեր՝ գենետիկական օտարության նշաններով, վիրուսներ և բջիջներ (հակամարմիններ);
- բարձր մոլեկուլային քաշի ածխաջրեր, մոնոսաքարիդային պոլիմերներ, գլիկոպրոտեիններ (լեկտիններ);
- միջուկային սպիտակուցներ, նուկլեոտիդիլտրանսֆերազներ (նուկլեինաթթուներ);
- ընկալիչներ, տրանսպորտային սպիտակուցներ (վիտամիններ, հորմոններ);
- սպիտակուցներ, որոնք փոխազդում են բջջային թաղանթների (բջիջների) հետ.
Այս տեխնոլոգիան օգտագործվում է նաև անշարժացված ֆերմենտներ ստանալու համար, և դրանք ցելյուլոզին կապելը թույլ է տալիս իմունոսորբենտներ արտադրել:
ԴՆԹ կապող սպիտակուցների քրոմատոգրաֆիա
ԴՆԹ կապող սպիտակուցների մեկուսացումն իրականացվում է օգտագործելովհեպարին. Այս գլիկոզամինոգլիկանը ունակ է կապելու մոլեկուլների լայն շրջանակ: Այս խմբի սպիտակուցների մերձավոր քրոմատոգրաֆիան օգտագործվում է այնպիսի նյութերի մեկուսացման համար, ինչպիսիք են՝
- թարգմանության մեկնարկի և երկարացման գործոններ (նուկլեինաթթվի մոլեկուլների և սպիտակուցների սինթեզ);
- սահմանափակողներ (ֆերմենտներ, որոնք ճանաչում են որոշակի հաջորդականություններ երկշղթա ԴՆԹ-ում);
- ԴՆԹ լիգազներ և պոլիմերազներ (ֆերմենտներ, որոնք կատալիզացնում են երկու մոլեկուլների միացումը՝ ձևավորելով նոր քիմիական կապ և մասնակցում են ԴՆԹ-ի վերարտադրությանը);
- սերինային պրոթեզերոնի ինհիբիտորներ, որոնք կարևոր դեր են խաղում իմունային և բորբոքային պրոցեսներում;
- աճի գործոններ՝ ֆիբրոբլաստ, Շվան, էնդոթելի;
- արտբջջային մատրիցայի սպիտակուցներ;
- հորմոնային ընկալիչներ;
- լիպոպրոտեիններ.
Արժանապատվություն
Այս մեթոդն ամենասպեցիֆիկներից է ռեակտիվ միացությունների (ֆերմենտներ և ավելի մեծ ագրեգատներ՝ վիրուսներ) մեկուսացման համար։ Այնուամենայնիվ, այն օգտագործվում է ոչ միայն կենսաբանական ակտիվ նյութերը մեկուսացնելու համար։
Փոքր քանակությամբ հակամարմինների հայտնաբերում, պոլիադենիլաթթվի քանակական գնահատում, դեհիդրոգենազների մոլեկուլային զանգվածների արագ որոշում, որոշ աղտոտիչների հեռացում, տրիփսինի ոչ ակտիվ ձևի ակտիվացման կինետիկայի, մարդու մոլեկուլային կառուցվածքի ուսումնասիրություն ինտերֆերոններ - սա այն ուսումնասիրությունների ամբողջ ցանկը չէ, որոնցում օգտագործվում է կապակցվածությունը, քրոմատոգրաֆիա: Կլինիկայում օգտագործումը պայմանավորված է իր առավելություններով, ինչպիսիք են՝
- Արդյունավետ մաքրման հնարավորությունսպիտակուցներ, պոլիսախարիդներ, նուկլեինաթթուներ: Նրանք փոքր-ինչ տարբերվում են իրենց ֆիզիկական և քիմիական հատկություններով և կորցնում են ակտիվությունը հիդրոլիզի, դենատուրացիայի և այլ մեթոդներում օգտագործվող բուժման այլ տեսակների ժամանակ։
- Նյութերի տարանջատման արագությունը, գործընթացի դինամիկ բնույթը.
- Հատուկ ֆերմենտային մաքրման և իզոֆերմենտային համասեռացման կարիք չկա տարանջատման հաստատունները որոշելու համար:
- Հնարավոր է առանձնացնել նյութերի լայն տեսականի։
- Լիգանդների ցածր սպառում.
- Նյութերի մեծ ծավալներով տարանջատման հնարավորություն։
- Կենսաբանական մակրոմոլեկուլների կապակցման շրջելի գործընթաց։
Այս տեխնիկան կարող է զուգակցվել մյուսների հետ՝ պարտադրելու լրացուցիչ դաշտ (գրավիտացիոն, էլեկտրամագնիսական): Սա թույլ է տալիս ընդլայնել քրոմատոգրաֆիայի տեխնիկական հնարավորությունները։
Ֆերմենտային ճարտարագիտություն
Այս մեթոդի շնորհիվ սկսվեց կենսատեխնոլոգիայի նոր ճյուղի՝ ֆերմենտային ճարտարագիտության ակտիվ զարգացումը։
Աֆինիտե քրոմատոգրաֆիան ֆերմենտային մեկուսացման համար ունի հետևյալ առավելությունները՝
- ավելի քիչ ժամանակի արդյունքում մեծ քանակությամբ ֆերմենտների ստացում, արդյունքում՝ դրանց գնի նվազում;
- ֆերմենտների անշարժացումը կարող է զգալիորեն ընդլայնել դրանց կիրառման շրջանակը բժշկության և արդյունաբերության մեջ;
- Ֆերմենտների կապը չլուծվող պինդ հենարանի հետ հնարավորություն է տալիս ուսումնասիրել միկրոմիջավայրի ազդեցությունը և ռեակցիաների ուղղությունը, որոնք կարևոր դեր են խաղում բնական և ֆիզիոլոգիական գործընթացներում։
