Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն մոլեկուլներ են, որոնք ձևավորվել են լաբորատոր գենետիկական ռեկոմբինացիայի տեխնիկայի միջոցով՝ մի քանի աղբյուրներից ստացված գենետիկական նյութը միավորելու համար: Դա հնարավոր է, քանի որ բոլոր օրգանիզմների ԴՆԹ-ի մոլեկուլներն ունեն նույն քիմիական կառուցվածքը և տարբերվում են միայն դրա ներսում գտնվող նուկլեոտիդային հաջորդականությամբ:
Ստեղծում
Մոլեկուլային կլոնավորումը լաբորատոր գործընթաց է, որն օգտագործվում է ռեկոմբինանտ ԴՆԹ ստեղծելու համար: Այն պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (PCR) հետ մեկտեղ ամենաշատ կիրառվող երկու մեթոդներից մեկն է։ Այն թույլ է տալիս վերահսկել փորձարարի կողմից ընտրված ԴՆԹ-ի ցանկացած որոշակի հաջորդականության կրկնօրինակումը:
Կա երկու հիմնարար տարբերություն ռեկոմբինանտ ԴՆԹ մեթոդների միջև: Մեկն այն է, որ մոլեկուլային կլոնավորումը ներառում է վերարտադրություն կենդանի բջիջում, մինչդեռ PCR-ն ներառում է in vitro: Մեկ այլ տարբերությունն այն է, որ առաջին մեթոդը թույլ է տալիս կտրել և կպցնել ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը, մինչդեռ երկրորդը բարելավվում է գոյություն ունեցող կարգը պատճենելու միջոցով:
Վեկտոր ԴՆԹ
Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ ստանալու համար անհրաժեշտ է կլոնավորման վեկտոր: Այն ստացվում է պլազմիդներից կամ վիրուսներից և համեմատաբար փոքր հատված է։ Մոլեկուլային կլոնավորման համար վեկտորի ընտրությունը կախված է հյուրընկալող օրգանիզմի ընտրությունից, կլոնավորվող ԴՆԹ-ի չափից և օտար մոլեկուլների դրսևորման համար: Սեգմենտները կարող են համակցվել՝ օգտագործելով տարբեր մեթոդներ, ինչպիսիք են սահմանափակող ֆերմենտի/լիգազի կլոնավորումը կամ Գիբսոնի հավաքումը:
Կլոնավորում
Ստանդարտ արձանագրություններում կլոնավորումը ներառում է յոթ քայլ:
- Ընտրեք հյուրընկալող օրգանիզմը և կլոնավորման վեկտորը։
- ԴՆԹ-ի վեկտորի ստացում:
- Կլոնավորված ԴՆԹ-ի ձևավորում.
- Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի ստեղծում.
- Ներկայացնելով այն հյուրընկալող օրգանիզմ:
- Այն պարունակող օրգանիզմների ընտրություն։
- Ցանկալի ԴՆԹ ներդիրներով և կենսաբանական հատկություններով կլոնների ընտրություն։
Հաղորդավար օրգանիզմ փոխպատվաստումից հետո ռեկոմբինանտ կառուցվածքում պարունակվող օտար մոլեկուլները կարող են արտահայտվել կամ չարտահայտվել: Արտահայտումը պահանջում է գենի վերակառուցում, որպեսզի ներառի այն հաջորդականությունները, որոնք անհրաժեշտ են ԴՆԹ-ի արտադրության համար: Այն օգտագործվում է հյուրընկալողի թարգմանչական մեքենայի կողմից:
Ինչպես է այն աշխատում
Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն աշխատում է, երբ հյուրընկալող բջիջն արտահայտում է ռեկոմբինանտ գեներից ստացված սպիտակուցը: Արտահայտությունը կախված է գենը մի շարք ազդանշաններով շրջապատելուց, որոնք հրահանգներ են տալիս դրա տառադարձման համար: Դրանք ներառում են պրոմոտոր, ռիբոսոմի կապող և տերմինատոր:
Խնդիրներն առաջանում են, եթե գենըպարունակում է ինտրոններ կամ ազդանշաններ, որոնք հանդես են գալիս որպես բակտերիալ հյուրընկալող տերմինատորներ: Սա հանգեցնում է վաղաժամ դադարեցման: Ռեկոմբինանտ սպիտակուցը կարող է սխալ մշակվել, ծալվել կամ քայքայվել: Դրա արտադրությունը էուկարիոտային համակարգերում սովորաբար տեղի է ունենում խմորիչների և թելավոր սնկերի մեջ։ Կենդանիների վանդակների օգտագործումը դժվար է շատերի համար ամուր աջակցող մակերեսի անհրաժեշտության պատճառով:
Օրգանիզմների հատկությունները
Օրգանիզմները, որոնք պարունակում են ռեկոմբինանտ ԴՆԹ մոլեկուլներ, ակնհայտորեն նորմալ ֆենոտիպեր ունեն: Նրանց արտաքինը, վարքը և նյութափոխանակությունը սովորաբար չեն փոխվում։ Ռեկոմբինանտ հաջորդականությունների առկայությունը ցույց տալու միակ միջոցը հենց ԴՆԹ-ի հետազոտությունն է՝ օգտագործելով պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի թեստը։
Որոշ դեպքերում ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն կարող է վնասակար ազդեցություն ունենալ: Դա կարող է տեղի ունենալ, երբ ակտիվ խթանող պարունակող նրա հատվածը գտնվում է նախկինում լուռ հյուրընկալող բջջային գենի կողքին:
Օգտագործել
Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ տեխնոլոգիան լայնորեն կիրառվում է կենսատեխնոլոգիայի, բժշկության և հետազոտությունների մեջ: Դրա սպիտակուցները և այլ արտադրանքները կարելի է գտնել արևմտյան գրեթե բոլոր դեղատներում, անասնաբուժական կլինիկայում, բժշկի գրասենյակում, բժշկական կամ կենսաբանական լաբորատորիայում:
Ամենատարածված կիրառումը հիմնարար հետազոտությունների մեջ է, որտեղ տեխնոլոգիան էական նշանակություն ունի կենսաբանական և կենսաբժշկական գիտությունների այսօրվա աշխատանքի մեծ մասի համար: Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն օգտագործվում է գեները նույնականացնելու, քարտեզագրելու և հաջորդականացնելու և դրանք որոշելու համարգործառույթները։ rDNA-ի զոնդերը օգտագործվում են գեների արտահայտման վերլուծության համար միայնակ բջիջներում և ամբողջ օրգանիզմների հյուսվածքներում: Լաբորատոր փորձերում որպես ռեակտիվ օգտագործվում են ռեկոմբինանտ սպիտակուցներ։ Որոշ կոնկրետ օրինակներ բերված են ստորև։
Ռեկոմբինանտ քիմոզին
Հայտնաբերված աբոմասումում քիմոզինը ֆերմենտ է, որն անհրաժեշտ է պանիր պատրաստելու համար: Դա արդյունաբերության մեջ օգտագործվող առաջին գենետիկորեն ձևափոխված սննդային հավելումն էր: Մանրէաբանականորեն արտադրված ռեկոմբինանտ ֆերմենտը, որը կառուցվածքով նույնական է հորթի ծագած ֆերմենտին, ավելի էժան է և արտադրվում է ավելի մեծ քանակությամբ:
Ռեկոմբինանտ մարդկային ինսուլին
Վիրտուալ փոխարինված ինսուլինին, որը ստացվում է կենդանական աղբյուրներից (օրինակ՝ խոզեր և խոշոր եղջերավոր անասուններ)՝ ինսուլինից կախված շաքարախտի բուժման համար: Ռեկոմբինանտ ինսուլինը սինթեզվում է մարդու ինսուլինի գենը Eterichia կամ խմորիչ սեռի բակտերիաների մեջ ներմուծելով:
Աճի հորմոն
Նշանակվում է այն հիվանդների համար, որոնց հիպոֆիզի գեղձը չի արտադրում բավարար աճի հորմոն՝ նորմալ զարգացման համար: Մինչև ռեկոմբինանտ աճի հորմոնը հասանելի կդառնար, այն ստացվում էր դիակների հիպոֆիզի գեղձից: Այս վտանգավոր պրակտիկան որոշ հիվանդների մոտ հանգեցրել է Կրոյցֆելդ-Յակոբ հիվանդության զարգացմանը:
Ռեկոմբինանտ կոագուլյացիայի գործոն
Սա արյունը մակարդող սպիտակուց է, որը կիրառվում է արյունահոսության խանգարումներով հեմոֆիլիայի ձևերով հիվանդներին: Նրանք չեն կարողանում արտադրելգործոն VIII բավարար քանակությամբ: Մինչև ռեկոմբինանտ VIII գործոնի ստեղծումը, սպիտակուցը արտադրվում էր բազմաթիվ դոնորներից ստացված մեծ քանակությամբ մարդու արյան վերամշակմամբ: Սա վարակիչ հիվանդությունների փոխանցման շատ բարձր ռիսկ է պարունակում։
ՄԻԱՎ վարակի ախտորոշում
ՄԻԱՎ վարակի ախտորոշման երեք լայնորեն օգտագործվող մեթոդներից յուրաքանչյուրը մշակվել է ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի միջոցով: Հակամարմինների թեստը օգտագործում է նրա սպիտակուցը: Այն հայտնաբերում է ՄԻԱՎ-ի գենետիկական նյութի առկայությունը՝ օգտագործելով հակադարձ տրանսկրիպցիոն պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա: Թեստի մշակումը հնարավոր է դարձել ՄԻԱՎ-ի գենոմների մոլեկուլային կլոնավորման և հաջորդականության շնորհիվ:
