Քանակական ՊՇՌ. արդյունքների վերլուծության և մեկնաբանման էությունը

2024 Հեղինակ: Curtis Blomfield | [email protected]. Վերջին փոփոխված: 2023-12-16 21:13

PCR կամ պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան բարդ լաբորատոր տեխնիկա է, որը լայնորեն կիրառվում է բժշկության մեջ և գիտական այլ ոլորտներում: PCR ախտորոշումը ժամանակին իսկական առաջընթաց դարձավ գիտության մեջ:

Նկարագրություն

Քանակական ՊՇՌ-ն իրական ժամանակի ՊՇՌ-ի տեսակ է:

Սա հասկացվում է որպես PCR-ի տարբերակ, որում անընդհատ գրանցվում է ռեակցիայի կինետիկան, ինչը հնարավորություն է տալիս որակապես գնահատել ԴՆԹ-ի հատուկ նուկլեոտիդային հաջորդականությունների պարունակությունը բարդ մոլեկուլային խառնուրդում:

Քանակական PCR մեթոդը ավելի մանրամասն կքննարկվի ստորև:

Վերլուծության էությունը

Հատկապես հաճախ օգտագործվում են մշակութային և շճաբանական մեթոդներ վարակների ախտորոշման համար: Առաջինի ներքո որոշվում են արյան շիճուկում վարակիչ հարուցչի հակամարմինները: Երկրորդում հիվանդ մարդուց վերցված կենսաբանական նյութն օգտագործվում է հատուկ միջավայր ցանելու համար, որը բարենպաստ է հարուցիչների գաղութների աճի համար։ Դիագնոստիկա երկուսն էլգործը կարող է տևել օրեր կամ շաբաթներ։

PCR հետազոտությունը կարող է իրականացվել տարբեր կենսաբանական նյութերով, որոնք ստացվում են հիվանդ մարդուց։ Որպես նմուշներ գործում են արյունը և այլ պաթոլոգիական, ֆիզիոլոգիական և կենսաբանական միջավայրերը և հեղուկները: Դուք կարող եք կատարել PCR կղանք կամ մեզ:

Ատիպիկ և վիրուսային վարակներն ամենից հաճախ ախտորոշվում են քանակական ՊՇՌ-ով, քանի որ դրանց ախտորոշումը կարող է դյուրին չլինել՝ պայմանավորված նրանց կողմից հրահրված պաթոլոգիական գործընթացի սպեցիֆիկ բնույթով: Նման վարակները որոշելու համար ժամանակ է պահանջվում, որի ընթացքում օրգանիզմում սկսում են արտադրվել հակամարմիններ՝ որոշված շճաբանական մեթոդներով։ Բայց դա որոշ դեպքերում անընդունելի է։

Կատարման մեթոդ

PCR մեթոդ - վարակի լաբորատոր հայտնաբերում հիվանդից մեկուսացված նմուշներում (in vitro):

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա անցկացնելու համար անհրաժեշտ է հատուկ ռեակտիվների հավաքածու:

Թեստային նյութը ներմուծվում է ռեակտիվներով փորձանոթների մեջ: Փորձարկման խողովակները տեղադրվում են հատուկ ապարատի մեջ՝ PCR ուժեղացուցիչ, որը նախատեսված է ցանկալի ՌՆԹ-ի կամ ԴՆԹ-ի բեկորների ուժեղացման (թիվը մեծացնելու) համար, PCR ուժեղացուցիչն աշխատում է ցիկլային ռեժիմով։ Ցանկացած ցիկլում, եթե նմուշները պարունակում են հարուցչի ՌՆԹ կամ ԴՆԹ հաջորդականություն, ապա այդ նուկլեինաթթուների մասնիկների ավելի ու ավելի շատ պատճեններ են կուտակվում լուծույթում։ Դուք կարող եք որոշել պաթոգենի առկայությունը և դրա քանակը նմուշներում:

PCR-ի տեսակները

Որակական վերլուծությունը PCR-ով թույլ է տալիս ստանալ հետևյալ արդյունքը՝

• բացասական է, երբ նմուշներում հետաքրքրող հարուցիչը չի հայտնաբերվել;
• դրական, եթե նմուշներում հայտնաբերվել են որոշակի պաթոգենին բնորոշ հաջորդականություններ:

ՊՇՌ-ի դրական արդյունքի դեպքում մենք կարող ենք 95% ճշգրտությամբ խոսել ախտորոշված վարակի առկայության մասին։ Միևնույն ժամանակ, ախտորոշման նպատակով օգտագործվող PCR հավաքածուների ճշգրտությունը հասնում է 100%-ի։

Սխալ արդյունքների 5%-ը սովորաբար որոշվում է մարդկային գործոնով։ Օրինակ, ռեակտիվների վերլուծության և պահպանման տեխնիկայի խախտումները կարող են զգալիորեն նվազեցնել հետազոտության ճշգրտությունը:

Քանակական ՊՇՌ-ն սահմանում է վիրուսային բեռի հասկացությունը: Հնարավոր է որոշել, թե հիվանդից վերցված նմուշներում քանի պաթոգեն ԴՆԹ է եղել:

Վարակի ծանրությունը ուղիղ համեմատական է դրանց քանակի ավելացմանը։ Դուք կարող եք նաև որոշել թերապիայի հաջողությունը՝ վիրուսային բեռը նվազեցնելու համար:

Ներկայացում PCR կենսանյութի համար

Քանակական ՊՇՌ-ն իրականացվում է կլինիկայում՝ հիմնականում առավոտյան ժամերին։ Բժշկի մոտ այցելության ժամանակ հիվանդին կպատմվի, թե ինչ է պետք ընդունել՝ քերծվածք, քսուք, մեզ կամ արյուն: PCR-ն կարող է հայտնաբերել պաթոգեններ՝ անկախ նյութի աղտոտվածության մակարդակից:

Դրական վերլուծության համար, տեսականորեն, նմուշներում պահանջվում է միայն մեկ հարուցչի առկայությունը: Գործնականում փորձում են էլ ավելի բարենպաստ պայմաններ ստեղծել։ Դրա համար կան մի քանի առաջարկներ.

• եթե սեռական օրգանից քերծվածք կամ շվաբր վերցնենօրգաններ, ուսումնասիրությունից երեք օր առաջ անհրաժեշտ է ձեռնպահ մնալ ինտիմ հարաբերություններից;
• դուք չեք կարող լվանալ հակաբակտերիալ դեղամիջոցներով կամ լվացվել անալիզից առաջ;
• միզուկից քսուք վերցնելուց երեք ժամ առաջ դուք պետք է համբերատար լինեք և չդատարկեք ձեր աղիքները:

Մի հետևեք այս կանոններին արյուն հանձնելիս։

Ինչպե՞ս են մեկնաբանվում քանակական PCR վերլուծության արդյունքները:

Ստացված արդյունքների քանակական գնահատում

Մի շարք կլինիկական իրավիճակներում ի հայտ է գալիս բուժման արդյունավետության և/կամ պաթոլոգիական գործընթացի դինամիկայի խնդիր։ Նման հարցերը հատկապես արդիական են քրոնիկական վարակներով (մարդու իմունային անբավարարության վիրուս, հեպատիտ B և C) ունեցող մարդկանց հետազոտելիս։ Ախտորոշելիս դրանք հիմնված են այն փաստի վրա, որ ամպլիկոնների (PCR արտադրանքների) կուտակումը համաչափ է վերլուծված նմուշում ցանկալի գենի պատճենների առկայությանը։

Իհարկե, հաշվի առնելով քանակական ՊՇՌ-ի արդյունքները, կատարվում է գելային էլեկտրոֆորեզ՝ հատուկ ՊՇՌ ազդանշանների ինտենսիվության ուսումնասիրությամբ։ Նաև ստացված արդյունքների ճիշտ քանակական գնահատման նախապայման է դրական վստահելի հսկողության նմուշները, որոնք պարունակում են ցանկալի գենի հայտնի թվով պատճեններ (օրինակ՝ հեպատիտ C-ի գենի հազար օրինակ մեկ PCR ռեակցիայի համար): Քանակական հսկողության մի քանի սերիական նոսրացումներ թույլ են տալիս ձևավորել տրամաչափման կորեր և օգտագործվում են կլինիկական նմուշներում կլինիկական գենոպատճենների բովանդակությունը գնահատելու համար:

Քանակական PCR-ի սահմանման մեջ հիմնական ձեռքբերումը եղել է ստեղծումը.լյումինեսցենտ ԴՆԹ-ի զոնդերը, որոնք ավելացվում են ռեակցիայի խառնուրդին միաժամանակ պարզ պրայմերներով և թույլ են տալիս ժամանակին հետևել PCR գործընթացին, այսինքն՝ իրական ժամանակում PCR:

TaqMan մեթոդաբանությունը վերաբերում է լյումինեսցենտ ԴՆԹ-ի զոնդերի սինթեզին, որոնք հատուկ են ամպլիկոնի միջին հատվածին և ունեն երկու պիտակ ծայրերում: Դրանցից մեկը լյումինեսցենտային պիտակ է, երկրորդը՝ հանգցնող մոլեկուլ այս ֆլյուորեսցենտության համար։

Հատուկ սարքը, որը ֆտորաչափի և թերմոբլոկ-ուժեղացուցիչի հիբրիդ է, կատարում է ֆլյուորեսցենցիայի մշտական չափումներ յուրաքանչյուր փորձանոթում (իրական ժամանակի PCR սկզբունք): PCR-ի 20-40 ցիկլից հետո յուրաքանչյուր նմուշի համար կստացվեն անհատական կորեր: Ցանկալի գենի պատճենների թիվը, որը պարունակվում է փորձանմուշում, կարելի է հաշվարկել ստուգիչ նմուշներով տրամաչափման կորերից:

Նաև, ֆլուորեսցենտային մեթոդով ՊՇՌ-ի իրականացման կարևոր առանձնահատկությունն այն է, որ արդյունքները հաշվի առնելիս կարիք չկա ՊՇՌ խառնուրդով խողովակներ բացել։ Սա նվազեցնում է սենյակի աղտոտման հնարավորությունը ուժեղացուցիչ արտադրանքներով, և կարիք չկա հատուկ աշխատանքային տարածքներ հատկացնել էլեկտրոֆորեզի համար:

Ի՞նչ է ցույց տալիս քանակական PCR տառադարձումը:

Ի՞նչ է հայտնաբերվում?

Մեթոդի միջոցով, ինչպիսին է քանակական PCR-ն, հայտնաբերվում են գեների որակական փոփոխություններ՝ ներդիրներ, ջնջումներ և կետային մուտացիաներ: Սակայն որոշ ժառանգական խանգարումների դեպքում համապատասխան ախտանշաններն ի հայտ են գալիս ի պատասխան որոշ գեների բովանդակության փոփոխության։

ՇնորհակալությունՔանակական վերլուծությունը տալիս է թվային արդյունք, առավել հաճախ IU/ml-ով: Սա նշանակում է, որ փորձանմուշի մեկ միլիլիտրում հայտնաբերվել է հարուցիչի ՌՆԹ-ի կամ ԴՆԹ-ի որոշակի պատճեններ՝ չափված միջազգային միավորներով։

Կախված մեծությունից՝ ախտորոշվում է վարակի ծանրությունը։ Արյունը սովորաբար ստուգվում է վիրուսային բեռը որոշելու համար, քանի որ հիվանդության ժամանակ վիրուսները արյան մեջ ազատ են շարժվում։

Հատկություններ

Քանակական PCR-ն արյան անալիզում ունի երկու առանձնահատկություն:

1. Վերլուծությունն իրականացվում է պրայմերների կամ դեզօքսիռիբոնուկլեոզիդ տրիֆոսֆատների առկայության դեպքում, որոնք պիտակավորված են լյումինեսցենտային կամ ռադիոակտիվ պիտակով՝ ձևավորված PCR արտադրանքի պարունակությունը ճշգրիտ որոշելու համար:
2. ՊՇՌ գործընթացում դադարեցրեք ռեակցիան շուտ, քանի դեռ շատ PCR արտադրանքներ չեն հայտնվել: Դա պայմանավորված է նրանով, որ հագեցվածության վերջնական փուլում, երբ կան շատ PCR արտադրանքներ, և՛ ֆերմենտը, և՛ սուբստրատները հանդես են գալիս որպես այս ռեակցիայի սահմանափակող օղակներ: Նման պայմաններում PCR-ի հաջորդ ցիկլի ավարտն այլևս չի բնութագրվում PCR արտադրանքների քանակի կրկնապատկմամբ, տարբեր նմուշների միջև աննշան քանակական տարբերություններ են հարթվում, որոնք բավականին հստակորեն սահմանվում են վաղ փուլերում՝ մի շարք ռեակցիաների ցիկլեր անցնելուց հետո:.

PCR ախտորոշման արժեքը

PCR հետազոտությունն ունի արժեք, որը կախված է նրանից, թե ինչպիսի վարակի կփորձարկվի, վերլուծության մեթոդաբանությունից և թեստի նյութից: Մեկ վարակը որոշելու համար դուք ստիպված կլինեք տալ ներսում200-800 ռուբլի: Կենսանյութ վերցնելու համար նույնպես ավելացվում է վճար՝ մոտավորապես 400 ռուբլի։