Հոսքի ցիտոմետրիան բջջաբանական հետազոտության մեթոդ է, որն օգտագործվում է բջիջների խորը վերլուծության համար: Դրա առավելությունն այն է, որ թույլ է տալիս ուսումնասիրել յուրաքանչյուր բջիջ առանձին։ Այս տեսակի վերլուծությունը օգնում է մի քանի վայրկյանում հարյուրավոր բջիջներում գնահատել մի քանի պարամետր: Արդյունքում, ցիտոֆտորիմետրիան համարվում է վերլուծության ամենաարագ և ճշգրիտ մեթոդներից մեկը, որն այժմ հասանելի է գիտնականներին և բժիշկներին:
Սկզբունք
Հոսքային ցիտոմետրիայի սկզբունքը հիմնված է բջիջների լույսի ցրման և լյումինեսցենտության (ֆլուորեսցենտության) չափման վրա։ Բջջային կախոցը հոսքի տեսքով մեծ արագությամբ անցնում է ցիտոմետրի բջիջով, որտեղ այն ճառագայթվում է լազերով: Այնտեղ նույնպես իրականացվում է այսպես կոչված հիդրոդինամիկական ֆոկուսավորում։ Դրա մեխանիզմն այն է, որ ելքի վրա ուսումնասիրված մասնիկներով բջջից հոսքը հոսում է դեպի արտաքին շիթ, որն ավելի մեծ արագություն ունի։ Արդյունքում մասնիկները դասավորված են դասավորված շղթայի մեջ։
Նախաբջիջները պիտակավորված են հատուկ լյումինեսցենտային ներկերով (ֆտորոքրոմներ): Նրանց շնորհիվ լազերային ճառագայթըգրգռում է երկրորդական փայլ: Ստացված լուսային ազդանշանները գրանցվում են դետեկտորներով։ Հետագայում տեղեկատվությունը մշակվում է ծրագրային ալգորիթմների միջոցով, որոնք թույլ են տալիս հաշվել առանձին բջիջների պոպուլյացիաները, որոնք տարբերվում են որոշ չափանիշներով:
Սովորական մանրադիտակով հետազոտությունը հաճախ չի կարողանում տարբերակել տարբեր բջիջները, քանի որ դրանք միանման տեսք ունեն: Ցիտոֆտորիմետրիան կարող է տրամադրել այլ տվյալներ (ԴՆԹ-ի կառուցվածքի ամբողջականությունը), վերլուծել սպիտակուցի արտահայտությունը, բջիջների գոյատևումը:
Քանի որ ֆտորոքրոմների գրգռումը պահանջում է տարբեր ալիքի երկարությամբ լույսի ճառագայթներ, ինչպես նաև տարբեր տեսակի դետեկտորներ, ժամանակակից կայանքները հագեցած են մի քանի հայտնաբերման ալիքներով (4-ից մինչև 30): Լազերային արձակողների թիվը կարող է լինել 1-ից մինչև 7: Ավելի բարդ սարքերը թույլ են տալիս միաժամանակ մի քանի մասնիկների մի քանի հատկությունների բազմապարամետրային ուսումնասիրություն:
Առավելություններ և թերություններ
Հոսքային ցիտոմետրիայի առավելությունները ներառում են՝
- մշակման բարձր արագություն (մինչև 30 հազար իրադարձությունների գրանցում 1 վայրկյանում);
- մեծ թվով բջիջներ ուսումնասիրելու հնարավորություն (նմուշում մինչև 100 միլիոն);
- Լյումինեսցենտային լույսի ինտենսիվության քանակականացում;
- Յուրաքանչյուր բջջի վերլուծություն;
- տարասեռ գործընթացների միաժամանակյա ուսումնասիրություն;
- տվյալների ավտոմատ տարանջատում ըստ բջջային պոպուլյացիաների;
- արդյունքների որակի արտացոլում։
Այս տեխնոլոգիայի մեկ այլ առանձնահատկությունն այն էվերլուծված մասնիկը կարող է ներկվել մի քանի լյումինեսցենտային լուծույթներով: Դրա շնորհիվ տեղի է ունենում բազմապարամետրային ուսումնասիրություն:
Թերությունները ներառում են տեխնիկական սարքավորումների բարդությունը և նմուշի հատուկ պատրաստման անհրաժեշտությունը:
Ցիտոմետրեր
Այս տեսակի առաջին սարքերը հայտնվել են արդեն 1968 թվականին Գերմանիայում, սակայն դրանք լայն տարածում են գտել շատ ավելի ուշ։ Ներկայումս բոլոր սարքերը, որոնք աշխատում են հոսքի ցիտոմետրիայի մեթոդով, կարելի է բաժանել 2 տեսակի՝
- սարքեր, որոնք չափում են լյումինեսցենտային ճառագայթումը (երկու կամ ավելի ալիքի երկարություն), 10° և 90° լույսի ցրումը (ցածր անկյուն և կողային ցրման դետեկտոր);
- սարքեր, որոնք, ի լրումն բջջային մի քանի պարամետրերի չափման, ավտոմատ կերպով դասավորում են խմբերի ըստ այս չափանիշների:
Առաջ ցրման դետեկտորը նախատեսված է բջջի չափը որոշելու համար, իսկ կողային ցրման սարքը թույլ է տալիս տեղեկատվություն ստանալ ներբջջային հատիկների առկայության, ցիտոպլազմայի և միջուկի ծավալային հարաբերակցության մասին։
Դասական ցիտոմետրերը, ի տարբերություն լուսային մանրադիտակների, թույլ չեն տալիս ստանալ բջջի պատկեր։ Այնուամենայնիվ, վերջին տարիներին ստեղծվել են համակցված սարքեր, որոնք ի վիճակի են համատեղել մանրադիտակի և ցիտոֆլորիմետրի հնարավորությունները։ Դրանք կքննարկվեն ստորև։
Պատկերային ցիտոմետրեր
Դասական հոսքային ցիտոմետրիայում օգտագործվող գործիքների համար,Հատկանշական է մի առանձնահատկություն՝ եթե վերլուծված բջիջների պոպուլյացիայի մեջ հազվադեպ դեպքեր են գրանցվում, ապա հնարավոր չէ գնահատել, թե որն է դրանց էությունը։ Այս մասնիկները կարող են լինել կամ մահացած բջիջների մնացորդներ, կամ դրանց հազվագյուտ խումբ: Սովորական սարքերում նման տվյալները բացառված են իրադարձությունների ընդհանուր հոսքից, բայց հենց դրանք կարող են առանձնահատուկ նշանակություն ունենալ գիտական և կլինիկական վերլուծության համար:
Պատկերող հոսքի ցիտոմետրերի նոր սերունդը թույլ է տալիս նկարել դետեկտորային գոտու միջով հոսքի մեջ անցնող յուրաքանչյուր բջիջի պատկերը: Դա հեշտ է տեսնել՝ սեղմելով գծագրի համապատասխան տարածքը, որը ցուցադրվում է համակարգչի մոնիտորի վրա:
Կիրառման ոլորտներ
Հոսքի ցիտոմետրիան ունիվերսալ մեթոդ է, որն օգտագործվում է բժշկության և գիտության բազմաթիվ ոլորտներում:
- իմունոլոգիա;
- ուռուցքաբանություն;
- տրանսպլանտոլոգիա (կարմիր ոսկրածուծի, ցողունային բջիջների փոխպատվաստում);
- հեմատոլոգիա;
- տոքսիկոլոգիա;
- կենսաքիմիա (բջջի ներսում թթվայնության չափում, այլ պարամետրերի ուսումնասիրություն);
- դեղաբանություն (նոր դեղերի ստեղծում);
- մանրէաբանություն;
- մակաբույծաբանություն և վիրուսաբանություն;
- օվկիանոսաբանություն (ֆիտոպլանկտոնի ուսումնասիրություն ջրային մարմինների վիճակը և այլ առաջադրանքներ գնահատելու համար);
- նանոտեխնոլոգիա և միկրոմասնիկների վերլուծություն.
Իմունոլոգիա
Մարդու իմունային համակարգը բաղկացած է բջիջների լայն տեսականիից: Իմունաբանության մեջ հոսքի ցիտոմետրիան հնարավորություն է տալիս գնահատել դրանց կառուցվածքը և գործառույթները, այսինքն՝ իրականացնել մորֆոֆունկցիոնալվերլուծություն.
Նման հետազոտությունն օգնում է հասկանալ իմունիտետի բարդ բնույթը։ Բջիջների ֆենոտիպերը փոխվում են անտիգենների ակտիվացման, պաթոլոգիաների զարգացման և այլ գործոնների արդյունքում։ Ցիտոֆտորոմետրիան կարող է առանձնացնել իմունային բջիջների ենթապոպուլյացիան բարդ խառնուրդում և գնահատել դրանց բոլոր փոփոխությունները ժամանակի ընթացքում:
Ուռուցքաբանություն
Ուռուցքաբանության ամենակարևոր խնդիրներից է բջիջների տարբերակումն ըստ տեսակի։ Օնկոհեմատոլոգիայում հոսքային ցիտոմետրիայի միջոցով վերլուծության սկզբունքը հիմնված է հետևյալ երևույթի վրա՝ երբ նմուշը մշակվում է հատուկ լյումինեսցենտային ներկով, այն կապվում է ցիտոպլազմային սպիտակուցների հետ։ Ակտիվորեն բազմացող բջիջներում բաժանվելուց հետո դրա պարունակությունը նվազում է կիսով չափ։ Համապատասխանաբար, բջջի լյումինեսցենցիայի ինտենսիվությունը նվազում է երկու անգամ:
Բազմացող բջիջները հայտնաբերելու այլ եղանակներ կան.
- ԴՆԹ կապող ներկերի օգտագործումը (պրոպիդիումի յոդիդ);
- պիտակավորված ուրացիլի օգտագործում;
- գրանցում ցիկլինային սպիտակուցների արտահայտման բարձր մակարդակի վրա, որոնք մասնակցում են բջջային ցիկլի կարգավորմանը:
